Thứ Hai, ngày 27 tháng 6 năm 2011

CHUONG 3 CẤU TẠO CHUỖI HÔ HẤP TẾ BÀO

Chương 3 :                  Cấu tạo chuỗi hô hấp tế bào
3.1. Cấu tạo ty thể
Trong tế bào, ty thể  là một bào quan màng kép được tìm thấy hầu hết ở các tế bào có nhân chuẩn. Đây là những bào quan có đường kính 0,5-10 μm. Ty thể đôi khi được mô tả như là "nhà máy điện của tế bào" bởi vì nó tạo ra hầu hết  nguồn năng lượng cung cấp cho tế bào là ATP, ATP được sử dụng như một nguồn năng lượng hóa học. Ngoài việc cung cấp năng lượng cho tế bào, ty thể còn tham gia vào các quá trình khác như: tín hiệu, sự khác biệt tế bào, sự chết tế bào, cũng như kiểm soát chu kỳ tế bào và sự tăng trưởng của tế bào. Ty thể còn liên quan đến  một vài căn bệnh ở người bao gồm các rối loạn ty   thể và rối loạn chức năng tim, và có thể có vai trò trong quá trình lão hóa. Từ ty thể có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp μίτος  hoặc mitos, thread + χονδρίον hoặc chondrion, hạt.
Một số đặc tính làm cho ty thể là bào quan duy nhất. Số lượng ty  thể trong một tế bào có sự thay đổi lớn tuỳ thuộc vào loài sinh vật và loại mô. Nhiều tế bào  có duy nhất một ty   thể, trong khi có  những loại tế bào khác có thể chứa đến vài ngàn ty   thể. Ty thể gồm có các vùng thực hiện các chức năng chuyên hoá. Những vùng hoặc khu vực bao gồm: màng ngoài, không gian giữa hai lớp màng, màng trong, răng lược và nội chất ty thể. Protein của ty thể khác nhau tùy thuộc vào loại  mô và loài sinh vật. Ở người, có 615 loại protein khác nhau có từ ty thể tim, trong khi đó ở chuột đã phát hiện được 940 protein mã hóa bởi gen khác nhau. Các protein của ty thể y có khả năng vận chuyển và thay đổi một cách linh động. Mặc dù hầu hết ADN của tế bào nằm trong nhân tế bào, ty thể có hệ gen độc lập với hệ gen của tế bào. Hơn thế nữa ,ADN của ty   thể có sự giống nhau đáng kể với bộ gen của vi khuẩn.
Ty thể bao gồm màng ngoài được cấu tạo bởi lớp photpholipit kép và lớp protein.Tuy nhiên hai màng có đặc tính khác nhau. Bởi vì tổ chức màng kép này có năm vùng riêng biệt trong ty   thể. Đó là màng  ngoài của ty thể, không gian giữa hai lớp màng (không gian giữa màng ngoài và màng trong), màng trong của ty   thể,  không gian của răng lược (được hình thành bởi sự gấp nếp của màng trong), và nội chất ( không gian bên trong của màng trong).
Màng ngoài của ty thể bao bọc toàn bộ bên ngoài, có tỷ lệ  protein/lipid  tương tự như của  màng sinh chất trong tế bào nhân chuẩn (khoảng 1:1 theo khối lượng). Nó chứa một số lượng lớn  protein xuyên màng gọi là lỗ. Những lỗ này tạo ra các kênh cho phép các phân tử có khối lượng phân tử 5.000 Dalton hoặc các phân tử có kích thước nhỏ  tự do khuếch tán từ một phía của màng đến phía bên kia. Các protein có kích thước lớn hơn có thể đi vào trong ty thể. Gây phá vỡ màng ngoài cho phép protein từ không gian giữa hai lớp màng đi vào trong tế bào chất, làm tế bào chết. Màng ngoài ty thể có thể kết hợp với màng lưới nội chất tạo cấu trúc được gọi là MAM (ty thể liên kết màng lưới nội chất). Điều này là quan trọng trong  tín hiệu canxi ở lưới nội chất-ty thể và tham gia vào việc vận chuyển các lipid giữa lưới nội chất và các ty thể.
Không gian giữa hai lớp màng là khoảng không gian giữa  màng ngoài và màng trong ty thể. Bởi vì màng ngoài được tự do thấm các phân tử nhỏ, nồng độ của các phân tử nhỏ như ion và đường trong không gian giữa hai lớp màng giống như trong tế bào chất. Tuy nhiên, các protein có kích thước lớn phải có một chuỗi tín hiệu cụ thể để được vận chuyển qua màng ngoài .Thành phần protein của không gian giữa hai lớp màng khác với thành phần protein trong tế bào chất. Một protein mà được xác định ở không gian giữa hai lớp màng  theo cách này là cytochrome c.
Màng trong  ty   thể  có chứa năm loại protein với các chức năng sau:
Thực hiện các phản ứng photphoryl hoá oxy hóa; tạo ra ATP trong nội chất; vận chuyển các chất cần thiết cho ty thể, phân giải các loại protein khác. Do đó nó chứa hơn 100 polypeptide khác nhau và có một tỷ lệ  protein /lipid rất cao (hơn 3:1 theo khối lượng).
Màng trong ty   thể chứa khoảng 1/5 tổng số protein của ty thể. Ngoài ra, màng trong ty thể rất giàu phospholipid, cardiolipin. Loại phospholipid này đã được phát hiện trong tim bò vào năm 1942. Cardiolipin chứa bốn axít béo chứ không phải hai và có thể giúp cho màng trong có tính thấm. Không giống như màng ngoài, màng trong ty thể không chứa lổ màng và nó cho tất cả các phân tử thấm qua. Hầu như tất cả các ion và các phân tử đều có những chất mang đặc biệt để có thể vào hoặc thoát ra khỏi nội chất. Ngoài ra, màng trong ty thể có sự hoạt động của các enzym trong chuỗi vận chuyển điện tử.
Màng trong của ty thể ngăn cách thành nhiều răng lược do đó làm tăng diện tích bề mặt của màng trong ty thể, tăng cường khả năng sản xuất ATP. Đối với ty thể tế bào gan, màng bên trong lớn hơn khoảng năm lần so với màng ngoài của ty thể. Tỷ lệ này có thể thay đổi và ty thể của các tế bào có nhu cầu ATP lớn, chẳng hạn như tế bào cơ thì chứa nhiều răng lược hơn. Những nếp gấp được gắn trên đó  các hạt tròn nhỏ mà chúng ta đã biết đó là các hạt F1 hoặc oxysomes. Đây không phải là gấp đơn giản  ngẫu nhiên mà là sự gấp nếp của màng trong ty thể, sự gấp nếp này có thể ảnh hưởng đến chức năng hoá sinh học.
Nội chất là không gian được bao bọc bởi màng trong. Nó chứa khoảng 2/3  tổng số protein của ty thể. Nội chất có vai trò quan trọng trong việc sản xuất  ATP với sự tham gia của enzym ATP synthase ở trên màng trong của ty thể. Nội chất là hỗn hợp chứa hàng trăm enzym, đặc biệt ở ty thể là ribosome, tARN và nhiều bản sao của bộ gen ADN ty thể. Các enzym có chức năng chính là oxy hóa các acid béo và pyruvate và chu trình axit citric.
Ty thể có vật liệu di truyền riêng và do đó có thể tổng hợp ARN và protein. Một chuỗi AND ty thể của người được có 16.569 cặp base nó mã hóa 37 gen: 22 tARN, 2 rARN và 13 gen peptide. 13 peptide trong ty thể ở người được tích hợp vào trong màng trong ty thể, cùng với các protein mã hóa bởi gen trong  nhân tế bào  chủ .
3.2.Cấu tạo chuỗi hô hấp
Chuỗi hô hấp là quá trình oxy hoá sinh học, nhờ vai trò xúc tác của hệ thống các enzym. Hay nói cách khác, nó là một hệ thống các phản ứng oxy hoá khử, trong đó hydro được tách ra từ các chất hữu cơ chuyển đến oxy để tạo thành nước. Việc vận chuyển hydro hay điện tử trong chuỗi hô hấp là do enzym xúc tác. Còn tiếp nhận oxy của tế bào sống - tế bào hô hấp là dấu hiệu bên ngoài của oxy hoá sinh học. Về bản chất hoá học của oxy hoá sinh học là một phản ứng kết hợp khí. Nhưng thực chất nó không phải chỉ xảy ra một giai đoạn và không thuộc loại kết hợp khí mà là phản ứng xảy ra từng bước giải phóng năng lượng.
Phần vận chuyển hydro có các enzym: dehydrogenase có coenzym là pyridinnucleotid, các enzym flavin và ubiquinon của chuỗi hô hấp. Phần vận chuyển điện tử có các cytochrom và cytochromoxidase. Mỗi phân tử NAD+, FAD+ và ubiquinon vận chuyển hai điện tử (gọi tắt là phần vận chuyển hai điện tử ), còn hệ thống cytochrom hoặc cytochromoxidase vận chuyển một điện tử (gọi tắt là vận chuyển một điện tử ) và oxy phân tử ở tận cùng chuỗi hô hấp bị khử bằng bốn bước, mỗi bước một điện tử :
Cơ chất SH2 Þ   NAD Þ  FAD Þ  Ubiquinon  ®  Cytochrom b ®Cytochrom c1® Cytochrom c® Cytochromoxidase ® O2
Kết quả vận chuyển hydro và điện tử bằng chuỗi hô hấp là tạo thành nước.
Căn cứ vào thế oxy hoá khử trong bảng 2.1. thì các tiểu phần chuỗi hô hấp sắp xếp phù hợp với thế oxy hoá khử của chúng, nghĩa là quá trình hô hấp diễn ra hàng loạt thế oxy hoá sinh học. Hệ thống này, sắp xếp theo trình tự từ cặp NADH/NAD+ có điện thế âm nhỏ nhất đến các cặp có điện thế tăng dần, cuối cùng là cặp O2/O2- có điện thế dương lớn nhất. Có thể nói hệ thống oxy hoá khử O2/O2- có khả năng oxy hoá tất cả thế năng của các chất trong sơ đồ. Do đó, người ta phân chia chuỗi hô hấp thành hai phần :
-Phần vận chuyển hydro
-Phần vận chuyển điện tử
E0   DG    SH2
            Volt   kJ/mol              NAD+
                                 FAD
      50     S    NADH2                                             Q          
                               FADH2                 2Fe3+
                                           QH2                                  2Fe3+
       62                                                  Cyt.b         2Fe3+  
                                                2Fe2+      Cyt.C1
                                                                  2H+                2Fe2+            Cyt.c    2Fe3+
105                                                                2Fe2+                    a-Cu-a3       ẵO2                                             2Fe2+      
                          O2

     
Hình 3.1.Sơ đồ mô tả chuỗi hô hấp (dựa theo Chance)
3.2.1. Phần vận chuyển hydro của chuỗi hô hấp
a) Các enzym có coenzym là pyridinnucleotid
Hydro được vận chuyển bởi một số coenzym, bao gồm nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD+) và nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphate (NADP+); cũng như các dẫn xuất của riboflavin là FMN (flavin-mononucleotid) và FAD (flavin-adenin-dinucleotid).
+NAD+ được tạo thành từ adenosin -5’-monophosphat với nicotinamit-ribosephosphat. Còn NADP+ được hình thành từ adenosin-5’-diphosphat với nicotinamitribosephosphat.
Nhờ chức năng vận chuyển hydro của các coenzym này mà chúng có thể tồn tại dưới hai dạng oxy hoá hay dạng khử tương ứng. Ở trạng thái oxy hoá thì Nitơ-pyridin của NAD+ hay NADP+ tích điện dương (dạng pyridinium); còn khi tiếp nhận hydro chúng chuyển thành trạng thái khử
Pyridinnucleotid khi thay đổi trạng thái oxy hoá hay khử thì đồng thời làm thay đổi hấp thụ quang phổ của các coenzym này. Chính vì vậy, vào năm 1936, Warburg đã phát hiện tổ hợp quang, mà ngày nay người ta sử dụng rất rộng rãi trong các phương pháp sinh hoá. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào cơ sở hai pyridinnucleotid NADH và NADPH ở dạng khử có tác dụng là coenzym của nhiều phản ứng enzym và hấp thụ cực đại ở bước sóng 340nm; ngược lại các dạng oxy hoá là NAD+ và NADP+ không hấp thụ bước sóng trong khoảng từ 300 đến 400 nm. Do đó, người ta có thể do thay đổi độ giảm sắc (Extinxtion) của từng phản ứng dehydrogenase ở bước sóng 340nm hay ở một chiều dài sóng khác như 334 và 366nm. Bằng phương pháp quang học, cho phép chúng ta nghiên cứu dễ dàng mối quan hệ giữa coenzym với protein - enzym. Cơ sở của vấn đề này là dựa vào sự biến đổi hấp thụ quang do liên kết coenzym đối với một vài dehydrogenase. Còn các phản ứng enzym khác không phụ thuộc vào pyridinnucleotid thì có thể do phối hợp với một hệ thống dehydrogenase tương ứng trong tổ hợp quang có trong trao đổi chất tế bào.
Ngày nay, người ta đã phát hiện khoảng trên 200 loại protein- enzym có coenzym hoặc là NAD+ hay NADP+ hoặc là cả hai pyridinnucleotid này. Các enzym này có trong tế bào chất và trong ty thể. Tuy số  dehydrogenase rất nhiều mà số phản ứng dehydro hoá lại có hạn.
Người ta cho rằng các pyridinnucleotid hydro hoá dưới dạng NADH chủ yếu tham gia vào các quá trình oxy hoá bên trong chuỗi hô hấp, còn NADPH tham gia chính là để thực hiện các quá trình tái tổng hợp. Trong chuỗi hô hấp NADH bị oxy hoá bằng các enzym flavin tiếp theo.
b) Các enzym flavin
Các flavinnucleotid gồm có flavin-mononucleotid (FMN) và flavin-adenin-dinucleotid (FAD) là những nhóm ngoại của các “enzym vàng” (flavo protein hay flavin-enzym ) có cấu tạo như sau :
Chúng đều là dẫn xuất của riboflavin và là những coenzym có chức năng vận chuyển hydro. Trong phân tử của FMN không chứa ribose mà là rượu ribitol (khác với các nucleotid khác), còn phân tử FAD gồm một nửa là FMN và nửa kia là AMP. Phần isoallosazin của cả hai coenzym này là hệ thống azaquinoid - thường tồn tại dưới ba dạng là :
      -Dạng oxy hoá : flavoquinon
      -Dạng bán khử : flavosemiquinon.
      -Dạng khử         : leucoflavin.
Khi đo quang phổ hồng ngoại và nghiên cứu đường hướng điện tử cho thấy : khi oxy hoá NADH bằng các enzym flavin xảy ra ở nhóm ngoại của chúng, lúc đó từ trạng thái flavoquinon chuyển qua trạng thái có tính chất “bán khử” là flavosemiquinon và cuối cùng tạo thành trạng thái khử hoàn toàn là leucoflavin
Quá trình khử xảy ra từng bước, trong đó từ vận chuyển hai điện tử nhanh chóng chuyển sang vận chuyển một điện tử. Cho nên, các flavin có khả năng tham gia vận chuyển hai hay một điện tử trong chuỗi hô hấp.
Đáng chú ý là đa số các enzym flavin có quan hệ chặt chẽ với các enzym NADH-dehydrogenase và succinatdehydrogenase. Chúng là những enzym quan trọng nhất của chuỗi hô hấp và là cầu nối những phản ứng dehydro hoá cơ chất với hệ thống vận chuyển điện tử giới hạn. Bên cạnh hai enzym này, người ta còn thấy trong chuỗi hô hấp có glycerin -1-phosphatdehydrogenase ty thể phụ thuộc vào FAD ( xem chuyên đề enzym) và cholindehydrogenase không mô tả trong chuyên đề enzym).
Không chỉ NADH - dehydrogenase mà còn cả succinatdehydrogenase cũng có cấu trúc và chức năng nên quan hệ chặt chẽ với hệ thống vận chuyển điện tử. Chúng là hệ thống thường xuyên thay đổi và là thành phần quan trọng gắn liền với màng trong ty thể. Do đó, việc tinh sạch và nghiên cứu đặc trưng sinh hoá của hai enzym này rất khó khăn. Người ta cho rằng NADH - dehydrogenase ty thể cơ tim liên kết chặt chẽ với nhóm ngoại FMN, còn succinathydrogenase lại liên kết chặt chẽ với FAD. Các coenzym này liên kết cộng hoá trị với protein - enzym.
Như đã đề cập trên, NADH - dehydrogenase bị khử bằng hydro của NADH, còn succinatdehydrogenase lại bị khử bằng axit malic (sản phẩm trung gian của chu trình Krebs). Cả hai enzym này đều bị oxy hoá bằng ubiquinon (coenzym Q). Người ta thường sử dụng chất nhận điện tử nhân tạo để nghiên cứu các enzym này. Kết quả cho thấy ferricyanid có tác dụng với NADH-dehydrogenase, còn phenazinmethio-sunfat có tác dụng với succinat-dehydrogenase, vì chúng là những enzym chuyên hoá cao. Ngoài ra, cả hai enzym này còn chứa một thành phần khác là sắt, nhưng không liên kết theo kiểu "Hem".
Trong những năm gần đây, người ta đã nghiên cứu sơ bộ về cấu trúc và liên kết hoá học của hai enzym này. Kết quả cho thấy NADH-dehydrogenase có khối lượng phân tử tối thiểu vào khoảng 70.000 (trên mỗi phân tử FMN) và mỗi đơn vị FMN có chứa sắt (Fe) và lưu huỳnh (S) với tỷ lệ 1:1:4 (FMN-Fe-S). Còn succinatdehydrogenase (chứa FAD) có trong lượng phân tử khoảng 97.000, do hai dưới đơn vị cấu thành. Một dưới đơn vị là flavoprotein vào khoảng 70.000, cho nên theo nguyên tắc trên một phân tử FAD liên kết nguyên tử với 4 nguyên tử sắt và 4 nguyên tử lưu huỳnh, còn dưới đơn vị kia là một sắt - lưu huỳnh -protein với khối lượng phân tử 27.000.
c) Ubiquinon ( coenzym  Q)
Các enzym flavin làm nhiệm vụ vận chuyển hydro từ NADH và succinat đến ubiquinon là thành phần tiếp theo của chuỗi hô hấp. Ubiquinon nằm giữa các enzym flavin và hệ thống cytochrom. Ubiquinon còn có tên gọi là coenzym  Q. Nó là hệ thống quinon chính của chuỗi hô hấp.
Lần đầu tiên, người ta phân lập ubiquinon từ ty thể tim bò. Còn trong ty thể nấm men và vi khuẩn là các dạng đồng phân, các đồng phân này tuỳ thuộc vào số đơn vị isopreoid mà có tên gọi tương ứng : Q7, Q8, Q9, Q10,.



Như trên đã nói, coenzym Q là giai đoạn  chính, vị trí cửa ngõ của hai con đường vận chuyển hydro chủ yếu của chuỗi hô hấp:

                                                                                          .......
                                                                                            

Con đường thứ nhất gọi là hệ thống NADH - CoQ - reductase và con đường thứ hai gọi là hệ thống malatdehydrogenase-CoQ- reductase. Cả hai con đường đều có sự tham gia của các flavoprotein, trong đó con đường thứ nhất phụ thuộc FMN, còn con đường thứ hai phụ thuộc FAD. Bên cạnh các flavoprotein, trong thành phần của cả hai hệ thống đều có các "Trung tâm sắt - lưu huỳnh" và được mô tả tương tự hệ thống oxy hoá khử và có lẽ chúng là thành phần bắt buộc của chuỗi hô hấp. Chúng có cấu tạo protein rất đơn giản mà sắt không có kiểu liên kết như sắt ở nhân "Hem". Protein này có ý nghĩa lớn lao đối với quá trình chế biến năng lượng.
Hệ thống NADH-CoQ-reductase có ý nghĩa quan trọng đối với thí nghiệm làm ngừng hô hấp bằng các chất amytal, rotenol và picricidin A. Những chất này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu chuỗi hô hấp và nhất là nghiên cứu trình tự các tiểu phần chuỗi hô hấp.
3.2.2. Phần vận chuyển điện tử của chuỗi hô hấp
Hệ thống cytochrom - chặng đường kết thúc vai trò của ubiquinon. Tiếp theo ubiquinon có thể là cytochrom b. Tại đây là bước ngoặt giữa hai pha chuỗi hô hấp - điểm làm thay đổi từ vận chuyển hai điện tử sang vận chuyển một điện tử. Hydro được tách ra từ các cơ chất khác nhau vận chuyển qua các giai đoạn trung gian đến ubiquinon, nhưng đến hệ thống cytochrom chỉ còn vận chuyển điện tử.
Phần vận chuyển điện tử của chuỗi hô hấp bao gồm từ các cytochrom b, c1, c, cytochromoxidase và oxy là chất nhận điện tử cuối cùng.
Những công trình nghiên cứu của Macmunn 1885-1886 về tế bào đã phát hiện các nhân tố gọi là tế bào "Hemin" hay "Cytohemin" hoặc còn gọi là "Histohematin". Đến 1925 thì Keilin, phát hiện lại nguồn gốc của các chất nói trên và mãi đến 1937 Keilin và Harter mới phân lập được cytochrom đầu tiên, đó là cytochrom c. Từ đó, việc phát hiện và nghiên cứu các cytochrom ngày càng được mở rộng.
Các cytochrom chỉ khác nhau ở các chuỗi bên. Nguyên tử trung tâm của hệ thống vòng porphyrin là sắt (dạng Fe2+ hay Fe3+) và có thể trao đổi hoá trị và thực chất nó là chất vận chuyển điện tử (bảng 3.2.)
Những liên kết giữa sắt porphyrin của từng cytochrom có tính chất chuyên hoá đối với hấp thụ ánh sáng. Hấp thu quang phổ chuyên hoá này có ý nghĩa quan trọng trong việc sắp xếp và nghiên cứu đặc trưng của các cytochrom.
Hàng loạt kết quả nghiên cứu cytochrom trong chuỗi hô hấp chủ yếu là xác định thế oxy hoá khử của chúng. Tuy nhiên về vị trí của một vài cytochrom còn chưa được giải thích thoả đáng. Người ta cho rằng ở vi khuẩn thì các cytochrom liên kết với màng vi khuẩn.
a) Cytochrom b
Cytochrom b nằm ở vị trí giữa ubiquinon và cytochrom c. Nó có khối lượng phân tử vào khoảng 17.000 (monomer) và có khuynh hướng tự ngưng tụ mạnh mẽ để tạo thành dạng trùng hợp cao phân tử với khối lượng có thể lên tới trên 4 triệu Cytochrom b liên kết rất chặt chẽ với màng trong ty thể.
Trong microsom, người ta phát hiện thấy có loại cytochrom b khác gọi là cytochrom b5. Nó có thể bị khử bằng NADH tạo thành phức hợp NADH-cytochrom b5-reductase. Sau đó cytochrom b5 bị oxy hoá bằng cytochrom c. Khi xác định quang phổ, người ta thấy cytochrom b5 không mang màu.
Nhóm cytochrom cũng tương tự như cytochrom a, bản chất của chúng có biểu hiện như là các lipoprotein.
b) Cytochrom c1
Cytochrom c1 cũng giống như cytochrom c, nhưng không thể thay thế cho nhau trong hệ thống vận chuyển điện tử. Hai cytochrom này khác nhau về bước sóng hấp thụ quang và nhiệt độ hoạt động tối ưu.
Vị trí của cytochrom c1 trong chuỗi hô hấp còn chưa rõ ràng. Theo những nghiên cứu đángtin cậy thì nó có thể chiếm một vị trí trên con đường chính của chuỗi hô hấp. Cytochrom c1 do có cấu trúc đặc biệt, nên khó hoà tan hơn cytochrom c. Cytochrom c1 có khối lượng phân tử vào khoảng 30.600.
c) Cytochrom c
Cytochrom c là một cytochrom được nghiên cứu nhiều hơn cả. Người ta đã nghiên cứu cấu trúc bậc nhất của cytochrom c. Nhân "Hem" liên kết cộng hoá trị với protein bằng những liên kết thioester. Cụ thể là liên kết xảy ra ở các gốc cystein 14 và 17 của chuỗi polypeptid với các nhóm 2 và 4 của "Hem". Do cấu trúc đặc biệt của nhân "Hem", nên có ảnh hưởng sâu sắc đến sự tạo thành xoắn ốc của protein. Khác với các cytochrom c dễ hoà tan trong nước nhưng trong ty thể nó lại có thể liên kết với các lipoprotein.
d) Cytochromoxidase (Cytochrom a + a3)
Cytochromoxidase còn gọi là enzym hô hấp Warburg, nó có thể coi là enzym tận cùng của chuỗi hô hấp, đứng về mặt oxy mà nói. Nó có ái lực rất lớn với oxy, cho nên nó bị oxy hoá bằng oxy với tốc độ lớn hơn nhiều so với các cytochrom b, c1 và c, và bị kìm hãm hoạt động mạnh bằng cyanid hay carbonmonoxid phản ứng với dạng hoá trị 2 của sắt (Fe2+) ở "Hem".
Mặc dù, cytochromoxidase liên kết rất chặt chẽ với màng trong ty thể, nhưng gần đây người ta cũng đã phân lập được loại enzym này. Kết quả cho thấy cytochromoxidase là những chuỗi polypeptid có độ lớn rất khác nhau và có khối lượng phân tử vào khoảng trên dưới 20.000. Cụ thể, cytochromoxidase của cơ tim được cấu thành từ 12 dưới đơn vị có khối lượng phân tử 6.000 và 36.000. Cho nên, khối lượng phân tử enzym hoàn chỉnh vào khoảng 170.000. Cấu trúc bậc nhất của các dưới đơn vị cũng đã được giải thích đầy đủ. Tuy nhiên, về phương diện cấu trúc bậc bốn của cytochromoxidase chưa được rõ ràng và còn ít tài liệu đề cập tới.
Mỗi phân tử enzym nguyên thể (170.000) có chứa hai nhóm "Hem" và hai ion đồng, đó là trung tâm oxy hoá khử của enzym giống như trung tâm oxy hoá khử sắt của các cytochrom khác, nhưng các ion đồng chỉ trao đổi hoá trị (Cu22+ + e- Cu+ ) và tham gia vào chức năng của cytochromoxidase.
Cytochromoxidase không chỉ là enzym oxy hoá khử mà còn là bơm ion (xem cơ chế phosphoryl hoá). Nó làm nhiệm vụ bơm proton qua màng ty thể từ trong ra ngoài, tạo thành một kênh ion qua màng ty thể để vận chuyển proton định vị. Cấu tạo phức tạp của enzym như vậy phù hợp với vai trò tác dụng kép (hai chức năng) của enzym là vận chuyển điện tử và bơm ion".
3.2.3. Chất nhận điện tử của chuỗi hô hấp
Trong những điều kiện sinh lý nhất định, các điện tử trong chuỗi hô hấp được chuyển đến oxy. Oxy lúc đó bị khử trở thành ion oxy (O2-), do đó phản ứng với proton (H+) đã hình thành từ đầu đến giai đoạn ubiquinon (xem sơ đồ chuỗi hô hấp ) để tạo thành nước. Như vậy, oxy là chất nhận điện tử giới hạn và đến đây kết thúc quá trình vận chuyển hydro và điện tử của chuỗi hô hấp.
3.2. Các phức hợp trong chuỗi hô hấp
Bằng các phương pháp khác nhau, người ta có thể sắp xếp chuỗi hô hấp thành bốn phần phức hợp enzym, mỗi phần đó được coi là các "vùng" (tiểu hệ thống ) của chuỗi hô hấp. Chúng có thể đặc trưng bằng những mức độ dưới đây :
-Phức hợp   I : Hệ thống NADH-ubiquinon-reductase.
                   II : Hệ thống succinat-ubiquinon-reductase.
                   III : Hệ thống ubiquinon-cytochrom c -reductase.
                   IV : Hệ thống cytochrom c-cytochromoxidase.
Các phức hợp này là những đơn vị chức năng quan trọng của màng trong ty thể. Về phương diện hàm lượng thì mỗi phức hợp có quan hệ chặt chẽ với các enzym, coenzym và nhóm ngoại. Trong qúa trình vận chuyển hydro và điện tử thì các phức hợp này cùng có tác dụng phối hợp.
Việc phân chia này dựa vào thế oxy hoá khử của các thành phần sắt-lưu huỳnh-protein trong mỗi giai đoạn riêng khác nhau. Do đó, mỗi phức hợp có khả năng vận chuyển điện tử và dự trữ năng lượng riêng. Những hệ thống vận chuyển như vậy còn gọi là các "kênh" truyền năng lượng (energietransducer- component). Ngoài các trung tâm "Fe-S-Pr", người ta thấy trong các phức hợp này còn có thể có các kim loại khác như molypden, mangan hay đồng và chúng cũng có vai trò vận chuyển điện tử và năng lượng như hệ thống "Fe-S".
Ngày nay, thông qua các phương pháp hiện đại như quang phổ, động học và kỹ thuật laze, các hệ thống oxy hoá khử này đang được nghiên cứu tích cực và khẩn trương. Từ những kỹ thuật hiện đại đó cho phép người ta có thể nghiên cứu một cách chi tiết và cụ thể trong từng giai đoạn vận chuyển hydro, vận chuyển điện tử và giải phóng năng lượng.
-Phức hợp I (NADH -ubiquinon-reductase): tiểu phần có khối lượng trên 500.000 và có chứa ít nhất 16 chuỗi polypeptid, nó được phân lập từ ty thể tim bò. Hai trong chúng có thể là flavoprotein phụ thuộc FMN và có thể có ba trung tâm sắt- lưu huỳnh-protein, tất nhiên cũng như các dưới đơn vị khác, hiện nay cũng chưa có những giải thích đầy đủ. Từ đó cho thấy, thực tế ty thể nguyên vẹn thì không thể oxy hoá NADH bên ngoài ty thể. Cho nên người ta cho rằng trung tâm oxy hoá NADH của phức hợp này (I) phải nằm bên trong ty thể, vì màng trong ty thể có hệ thống enzym nhận biết NADH.
-Phức hợp II (succinat-ubiquinon-reductase): thực chất là succinat - dehydrogenase gồm có hai chuỗi polypeptid liên kết cộng hoá trị với một phân tử FAD và có một trung tâm "sắt-lưu huỳnh-protein ". Enzym này còn thấy có trong nội chất màng trong ty thể, nghĩa là enzym có thể di chuyển vào màng trong ty thể.
Ubiquinon có tác dụng là chất tiếp nhận hydro trong phức hợp I và phức hợp II. Nó là phân tử kỵ nước (hydrophob) trong lớp lipit kép của màng ty thể. Bằng hình thức như vậy, ubiquinon thực hiện đầy đủ chức năng kết hợp giữa các đoạn vận chuyển hydro và điện tử của chuỗi hô hấp hiệu quả cao nhất.
-Phức hợp III (ubiquinon-cytochrom c-reductase): có khối lượng tiểu phần vào khoảng 300.000 (protein + lipid) và có 6 đến 8 chuỗi polypeptid cấu thành. Trong đó, hai hay ba chuỗi polypeptid có chứa cytochrom b, một chuỗi chứa cytochrom c1 và một chuỗi chứa trung tâm sắt-lưu huỳnh-protein; một chuỗi polypeptid có thể liên kết với atimycin và các chuỗi còn lại chưa rõ chức năng.
Protein của cytochrom b rất kỵ nước và người ta cho rằng : chất truyền điện tử này cũng giống như ubiquinon là định vị giữa lớp lipid kép của màng trong ty thể. Cytochrom trong phức hợp III hình như được chuyển ra phía ngoài màng ty thể. Như vậy, nó có vai trò là chất truyền điện tử tương tự như cytochrom c. Cytochrom c, cũng sắp xếp ở vùng ngoại vi, nghĩa là nó định vị ở mặt ngoài của màng trong ty thể.
-Phức hợp IV (cytochrom c-oxidase) : truyền dẫn qua màng trong ty thể, nghĩa là nó có thể truyền từ phía ngoài vào phía trong. Cytochrom a có thể nằm ở phía ngoài và tại đó tiếp nhận điện tử từ cytochrom c; phức hợp này phản ứng với phần phản ứng với phần phản ứng oxy hướng vào phía bên trong - nơi có cytochrom a3. Giữa hai phần thấy có hai nguyên tử đồng nằm bên trong lớp lipid kép và được coi là chất truyền điện tử giữa các nhóm "Hem" từ a đến a3. Như vậy, oxy đã oxy hoá cytochrom a3 phải vượt qua màng ty thể và có thể phản ứng với cytochrom này.
3.3. Mối quan hệ giữa ty thể và hô hấp
3.3.1. Thay đổi thể tích ty thể
Ty thể có hai kiểu biến đổi thể tích : một là biến đổi thể tích bị động và hai là biến đổi thể tích chủ động.
Biến đổi thể tích bị động do tính thấm của môi trường quyết định. Vì ty thể dễ cảm ứng với áp suất thẩm thấu, cho nên trong môi trường ưu trương có hiện tượng co hẹp lại và trong những dung dịch nhược trương lại trương lên, cuối cùng có thể vỡ tung ra. Khi trương phồng dẫn đến giải phóng protein -enzym và NAD+ đã liên kết, kết quả làm kìm hãm phosphoryl hoá oxy hoá. Các enzym chủ đạo có thể bị thay đổi hoạt động trong quá trình trương phồng ( ví dụ ATPase). Hiện tượng trương phồng có thể theo dõi bằng thay đổi độ đục của huyền phù ty thể.
Ngược lại, biến đổi thể tích chủ động phụ thuộc vào năng lượng và có liên quan chặt chẽ với vận chuyển điện tử và phosphoryl hoá. Ví dụ, các ty thể gan chuột ở bước 4 theo Chance (có nghĩa là dư thừa cơ chất và oxy mà thiếu ADP thì vẫn giảm hô hấp) thì bị trương phồng. Hiện tượng này mất đi, khi người ta thêm ADP vào bước 3 (nghĩa là dư thừa cơ chất, oxy và ADP làm cho hô hấp tăng mạnh ), như vậy làm giảm trương phồng. Qua thí nghiệm này, chứng tỏ ty thể có loại trừ dịch lỏng một cách chủ động. Quá trình trình diễn ra như trên, gọi là "Chu trình trương phồng - co hẹp", nghĩa là chu trình này bao gồm hai quá trình biến đổi thể tích chủ động là " trương phồng chủ động và co hẹp chủ động ".
Người ta thấy các chất có khả năng làm trương phồng ty thể là Ca2+, phosphat vô cơ, axit béo tự do, thyroxin, oxytoxin, vasopressin,v.v..Ngoài ra, đa số các kháng sinh có tác dụng vận chuyển điện tử trong ty thể thì cũng có tác dụng làm trương phồng ty thể tương tự như qúa trình trương phồng phụ thuộc năng lượng.
Những ty thể đã trương phồng, co hẹp lại mức độ bình thường là nhờ xảy ra phosphoryl hoá oxy hoá. Còn khi thêm ATP vào những ty thể đã trương phồng, gây nên co hẹp, đặc biệt rõ ràng, khi có mặt các ion Mg2+ hay Mn2+. Nguyên nhân co hẹp này có lẽ do ATP bị thuỷ phân. Một phân tử ATP có thể loại đi đến 2000 phân tử nước từ ty thể đã bị trương phồng.
3.3.2.Hoạt tính của ATPase ty thể
ATPase xúc tác phản ứng thuỷ phân ATP và như vậy nó có vai trò điều hoà hô hấp tế bào. Trong các ty thể nguyên vẹn, thì hoạt động của ATPase rất yếu, nhưng khi ty thể bị tổn thương hoặc trong môi trường nhược trương hay ưu trương, hoạt động của enzym này tăng lên. Hoạt động của ATPase phụ thuộc vào trạng thái oxy hoá khử của các thành phần chuỗi hô hấp. Khi có phản ứng khử quá mạnh, ATPase bị kìm hãm 100%. ATPase tăng hoạt động, khi ủ ty thể ở 370C và không có mặt các adeninnuclotid và cơ chất oxy hoá. Đa số các chất loại trừ kết hợp, cũng như già hoá ty thể làm tăng hoạt động của ATPase, còn ATP kìm hãm hoạt động của enzym này. Như vậy, phản ứng của ATPase là ngược với phosphoryl hoá oxy hoá .
3.3.3. Tính thấm qua màng ty thể
Màng trong ty thể được coi như một bức tường ngăn cách giữa bên trong với bên ngoài ty thể. Người ta đã chứng minh rằng các chất pyruvat và b-hydroxybuterat có thể thấm qua màng ty thể, còn các chất di-, tricarboxylic của chu trình Crebs, cũng như dẫn xuất của coenzym A lại không thấm qua màng ty thể một cách tự do. Còn các adeninnucleotid, pyridinnucleotid và phosphat vô cơ thấm qua màng ty thể với mức độ nhất định.
Nếu NADH thêm từ bên ngoài vào ty thể nguyên vẹn thì chỉ bị oxy hoá, khi thêm cytochrom c vào. Bằng cách oxy hoá như vậy, thấy xảy ra phosphoryl hoá. Nhưng sau một cái Schock thẩm thấu, thấy tính thấm của màng tăng lên, còn NADH bị oxy hoá trong ty thể mà không thêm cytochrom c vào thì lại thấy tổng hợp ATP.
gười ta cho rằng các chất làm trương phồng ty thể thì cũng làm tăng tính thấm của màng và làm hao hụt pyridinnucleotid trong ty thể, trong đó NAD+ nhờ hỗ trợ của ATP. Ngăn ngừa tạo thành NADH tế bào chất hoặc các chất khử tương đương ty thể là do nhiều hệ thống vận chuyển chịu trách nhiệm. Hai trong số các hệ thống vận chuyển được trình bày như sau . Những hệ thống vận chuyển hydro khác là hệ thống Oxalacetat - malate và oxalacetat - aspartat.
Còn vận chuyển adeninnucleotid qua màng trong ty thể là nhờ những chất mang nhất định. ADP được vận chuyển từ tế bào chất vào ty thể nhờ chất mang tương ứng của nó và sau đó tạo thành lại nhờ chính chất mang ADP vận chuyển ATP ra ngoài ty thể. Vận chuyển là một quá trình  trao đổi bắt buộc, vì cứ mỗi phân tử ADP vận chuyển theo chiều thuận vào trong thì phải mang một phân tử ATP theo chiều ngược lại ra ngoài. Do đó mà tổng số adeninnucleotid của ty thể luôn luôn là một hằng số. Các chất glucosid-atractylosid là một chất kìm hãm đặc hiệu của vận chuyển adeninnucleotud.
Trong những ty thể có kết hợp thì vận chuyển ADP vào tỷ lệ nghịch với ATP, nhưng các ty thể loại trừ kết hợp thì vận chuyển giữa hai nucleotid không khác nhau. Mối tương quan này trong hệ thống vận chuyển dẫn đến phân chia cân đối của ADP với ATP ở hai phía của màng. Tỷ lệ ATP/ADP bên ngoài ty thể lớn hơn bên trong.
3.3.4.Tính chất của hệ thống vận chuyển ion
Ty thể không những có khả năng vận chuyển anion mà còn vận chuyển cả cation về hai phía của màng. Vận chuyển ion của ty thể có ý nghĩa lớn lao đối với điều hoà và phối hợp chặt chẽ giữa các quá trình trao đổi chất bên trong với bên ngoài ty thể. Những nghiên cứu đầu tiên về tthr cho thấy rằng các quá trình hô hấp và phosphoryl hoá có khả năng duy trì hàm lượng các cation và anion hoá trị I cũng như hoá trị 2 của chúng và ty thể được coi như một acqui-ion (bình tích ion).
Người ta thấy rằng trong có thể sinh vật có nhiều chất kháng ion khác nhau trong đó quan trọng nhất là các chất như ATP, ADP, AMP, pyridinnucleotid và phosphat vô cơ. Khi vắng mặt các cơ chất oxy hoá hay trong môi trường nhược trương thì thực tế ty thể mất K+ và Na+ hoàn toàn, trong khi đó hàm lượng Mg2+ và Ca2+ còn khoảng một nửa so với bình thường và ở dạng liên kết cấu trúc trong ty thể.
Như đã nói trên màng trong ty thể có thể coi là một chướng ngại vật đối với quá trình vận chuyển ion vào ty thể, cụ thể là đối với vận chuyển các ion H+ và HO-. Người ta cho rằng các hiện tượng hạn chế quá trình oxy hoá và phosphoryl hoá thải nhiệt ở màng trong là những quá trình tích điện ngược với gradien nồng độ.
Đặc biệt đáng chú ý là vận chuyển Ca2+ của ty thể. Theo Lehninger, quá trình vận chuyển Ca2+ dựa vào tính chất chuyên hoá rộng rãi, ái lực cao, tích tụ nhiều Ca2+ có ý nghĩa đối với chu trình co cơ cũng như đối với những quá trình calcium hoá phân tử .Về phương diện cung cấp năng lượng thì acqui Ca2+ có thể coi là thời điểm để giàu năng lượng trong hàng loạt các phản ứng sinh năng lượng của phosphoryl hoá chuỗi hô hấp.

1 nhận xét: