CHƯƠNG 4 : ATP VÀ SỰ TỔNG HỢP ATP

Chương 4 :  ATP và sự tổng hợp ATP

4.1. ATP - Trung tâm của trao đổi chất tế bào

Tên gọi chung của tất cả các quá trình trao đổi chất trung gian là hiệu quả năng lượng của những biến đổi các chất hữu cơ, trong đó ATP được coi là dạng năng lượng dự trữ, nó có thể tham gia trao đổi trong các quá trình hoá học khác nhau. Phần lớn là các quá trình phản ứng hoạt hoá như trao đổi hydratcarbon, trao đổi axit béo, trao đổi các hợp chất chứa nitơ (axit amin, protein, axit nucleic...)..đều có tham gia của ATP.

Như vậy, ATP vừa là chất tích luỹ năng lượng; đồng thời vừa là chất cung cấp năng lượng. Những công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh ATP còn giữ vai trò là chất gây ra biến đổi năng lượng. ATP có thể chuyển năng lượng dạng tĩnh của các liên kết hoá học thành năng lượng dạng động, nghĩa là năng lượng kích thích các phân tử làm cho các phân tử có thể phản ứng với nhau. Ví dụ : ATP tham gia vào các quá trình hình thành các nhóm hoạt động. Do đó, người ta có thể nói : "ATP là trung tâm của trao đổi chất tế bào".

5.1.1.Đặc trưng cấu trúc và tính chất của hệ thống adenylic

Vào năm 1847, Liebig, người đầu tiên phát hiện axit inosinic, đây là dấu hiệu mở đầu cho việc nghiên cứu nucleotid. Một trăm năm sau, năm 1940, người ta tìm được khoảng 10 liên kết thuộc nhóm nucleotid này, nhưng chỉ khoảng thời gian hai mươi năm tiếp theo, năm 1960, người ta đã biết tới trên 150 nucleotid khác nhau. Từ những sự kiện này là cơ sở để đẩy mạnh việc nghiên cứu chính xác những phản ứng tế bào quan trọng nhất, như vòng tuần hoàn hydro (Warburg), vòng tuần hoàn phosphat (Engelhardt) và nhóm điện thế (Lipmann).

Nucleotid tự do có chức năng cực kỳ quan trọng trong trao đổi chất tế bào, đặc biệt chúng tham gia vào các quá trình vận chuyển các nhóm khác nhau. Dựa vào kết quả xác định hàm lượng thay đổi của các nucleotid mà người ta có thể phán đoán được đặc trưng chuyển hoá của mô hay cơ quan. Cho nên có thể coi nucleotid là chỉ thị của sự chuyển hoá tế bào.

Trong số các nucleotid đã phát hiện thì trong tế bào có nhiều nucleotid -polyphosphat. Ví dụ như các liên kết giữa ađenosin với ortophosphat là AMP, ADP và ATP. Lohmann là người đầu tiên đã phát hiện và phân lập được ATP cách đây hơn 50 năm. Sau đó Marrion cũng đã phân lập được adenosin-5'-tetraphosphat và adenosin-5'-pentaphosphat là những dẫn xuất từ ATP. Tuy nhiên các tetra- và pentaphosphat chưa được chứng minh về ý nghĩa sinh học của chúng một cách chắc chắn.

 

Hình 4.1.Cấu trúc của hệ thống adenylic.

Adenosin-5'-triphosphat (ATP) là một mononucleotid gồm có các thành phần :

Bazơ chứa nitơ là adenin.

Đường pentose là ribose và

Ba gốc phosphat nằm thẳng hàng với nhau.

Liên kết giữa các gốc phosphat là liên kết kiểu anhydrid (Lohmann)

Những chất tương tự ATP, nhất là các adenosinnucleotid mà có hai gốc phosphat là adenosin-5'-diphosphat (ADP) và một gốc phosphat là adenosin-5'-monophosphat (AMP). Các liên kết này có ý nghĩa tổng hợp trong việc vận chuyển nhóm và năng lượng, đặc biệt là vận chuyển kết hợp giữa phosphat với năng lượng.

Do bản chất hoá học của ATP mà nó có vai trò vô cùng quan trọng trong trao đổi chất tế bào. Dựa vào hàm lượng năng lượng của liên kết O-P mà Lipmann đề nghị dùng dấu ngã (~) để phân biệt với các liên kết không giàu năng lượng khác. Ông cho rằng năng lượng giải phóng khi thuỷ phân hai liên kết cao năng trong phân tử ATP vào khoảng 8-12 kcal/mol.

Ngày nay, người ta qui định những liên kết, khi thuỷ phân cho từ 5 kcal/mol trở lên đều gọi là liên kết cao năng (liên kết thế năng cao hay liên kết giàu năng lượng ). Những nghiên cứu đầ đủ và chính xác cho thấy rằng trong các điều kiện tiêu chuẩn mà ở pH=7,0 thì thuỷ phân liên kết phosphat ở giữa là 9,40kcal/mol. Kết quả đó có thấp hơn so với mức năng lượng sử dụng để tổng hợp chúng. Tất nhiên trong hệ thống sinh học ít có thể đạt được các điều kiện tiêu chuẩn, nên kết quả thu được có khác (ví dụ điều kiện sinh lý thì ATP/ADP=100:1 và H₃PO₄ là 0,001M), do đó khi thuỷ phân ATP thành ADP và H₃PO₄ giải phóng tới 14,60 kcal/mol.

Những điều vừa trình bày trên cũng chưa thể nói hết vai trò của ATP trong quá trình vận chuyển phosphat và năng lượng, cũng như phân tử ATP có tính chất phản ứng nhiều mặt. Khi đi sâu nghiên cứu, người ta thấy: Sở dĩ hàm lượng năng lượng của những liên kết phosphat cao năng trong ATP là do hai nguyên tử oxy của γ và β-phosphat tích điện dương lớn hơn là nguyên tử oxy của α-phosphat (theo B.và A.Pullmann).

 

Hình 4.2.Kiến trúc điện tích trên phân tử ATP

Chính sự phân phối điện tích khác nhau như vậy trong phân tử ATP đã tạo ra cho ATP có khả năng tham gia vào nhiều phản ứng trao đổi chất và trao đổi năng lượng khác nhau trong hệ thống sinh học.

Phản ứng của ATP có thể xảy ra theo bốn khả năng, trong đó một mặt là vận chuyển ortophosphat hay pyrophosphat và mặt khác là vận chuyển nhóm adenylic hoặc adenosin.

Như vậy chứng tỏ ATP có tác dụng lên đa số các phản ứng trao đổi chất. Đặc biệt ATP là chất mang phosphat và năng lượng trong chuỗi hô hấp  và đường phân (glycolyse). Nó có vai trò hoạt hoá axit amin, hoạt hoá axit béo, hoạt hoá các nucleotid,v.v...đối với các quá trình tổng hợp và phân giải các chất này. Ngoài ra ATP còn có vai trò trong việc tạo thành "sunfat", "methyl" hoạt động,v.v...Bên cạnh đó, ATP còn có chức năng sinh học trực tiếp trong hiện tượng co cơ, tham gia trực tiếp vào vận chuyển ion, các quá trình hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau. Bởi vì ATP không chỉ là cơ chất để tổng hợp axit nucleotid mà còn là chất chế biến năng lượng cho các phản ứng kích thích tổng hợp và phân giải các chất. Mặt khác ATP là sản phẩm phosphoryl hoá trực tiếp của ADP, do đó nó cod tính axit mạnh và có nhiều nhóm hydroxyl (-OH), vì vậy nó có thể đảm nhiệm chức năng phản ứng nhiều mặt trong hệ thống sống.

4.1.2. Vai trò của ATP trong trao đổi chất

Như ta đã biết, adenosintriphosphat là một chất chế biến và vận chuyển năng lượng. Nó được tạo thành trong quá trình phân giải các chất khác nhau như oxy hoá các chất trong ty thể, đường phân và lên men, quang hợp ở diệp lục của thực vật xanh và các quá trình vận chuyển ion ở vi khuẩn,...Ngược lại, ATP cũng là chất cung cấp năng lượng cho các quá trình tổng hợp của cơ thể sinh vật. Đó là các phản ứng gắn liền với phân giải phân tử ATP, công co cơ, sinh tổng hợp các chất protein, axit nucleic,...cũng như sản sinh và duy trì tính phân bố không đều các chất giữa tế bào với môi trường xung quanh.

Trong các phần trước cho thấy, sự thay đổi năng lượng tự do âm, khi thuỷ phân nhóm phosphat tận cùng của ATP lớn hơn là khi thuỷ phân liên kết esterphosphat. Ví dụ khi thuỷ phân phosphat tận cùng của ATP năng lượng giải phóng vào khoảng DG⁰ = - 32,7 kJ/mol, còn thuỷ phân liên kết esterphosphat của glucose-6-phosphat chỉ giải phóng năng lượng tự do vào khoảng DG⁰ = - 12,6 kJ/mol.

 Khác biệt này, do năng lượng tự do tích luỹ trong liên kết năng lượng và liên kết cao năng khác nhau. Đa số, các liên kết giàu năng lượng là các liên kết phosphat có cấu trúc anhydrid (như ATP, ADP, acetyphosphat, aminoacetyl-adenylat, pyrophosphat,...), có cấu trúc enolphosphat (phosphoenolpyruvat), và cấu trúc phosphoguanidinphosphat (creatinphosphat), cũng như thioester (ví dụ acetyl-CoA) và S-adenosylmethionin (methionin hoạt động). Còn các liên kết nhiệt lượng thì khi thuỷ phân, nhiệt năng giải phóng nhỏ hơn -16 kJ/mol, thường là các sản phẩm trung gian của đường phân như glucose -6-phosphat, fructose-6-phosphat, glycerat-3-phosphat,v.v...

Vận chuyển một liên kết esterphosphat từ chất cho phosphat đến chất nhận phosphat có ý nghĩa quan trọng trong trao đổi chất. Quá trình này gọi là chuyển phosphoryl hoá. Dựa vào ý nghĩa của các phản ứng vận chuyển như vậy, người ta đề xuất khái niệm “Thế năng nhóm vận chuyển “.

Những liên kết giàu năng lượng có thế năng vận chuyển nhóm cao, ví dụ như hai phản ứng chuyển phosphat mô tả ở trên mà có ATP là chất cho phosphat. Khi chuyển esterphosphat tận cùng của ATP lên glucose là chất nhận (tạo thành esterphosphat với thế năng vận chuyển phosphat thấp) làm giảm năng lượng tự do và phản ứng không thuận nghịch. Còn chuyển phosphat từ ATP đến AMP hay từ ATP đến creatin dẫn đến tạo thành các liên kết phosphat giàu năng lượng (ADP hoặc A-R-P~P hay creatin~P). Như vậy, các phản ứng này xảy ra giữa các liên kết có thế năng vận chuyển nhóm cao, nghĩa là không thải nhiệt tự do và xảy ra thuận nghịch.

4.1.3. Những liên kết giàu năng lượng với phản ứng phối hợp

Những biến đổi vật chất trong cơ thể sống được chia làm ba nhóm :

-Các phản ứng tiêu hao năng lượng (các quá trình endergone, phần lớn là các phản ứng tổng hợp).

-Các phản ứng cung cấp năng lượng (các quá trình endergone, phần lớn là các phản ứng phân giải).

-Những biến đổi vật chất mà không có biểu hiện năng lượng cơ bản.

Kết hợp giữa những phản ứng tổng hợp - tiêu hao năng lượng với các phản ứng phân giải cung cấp năng lượng, thực hiện bằng chất mang năng lượng. Những liên kết có chức năng mang năng lượng thường có hàm lượng năng lượng cao (thế năng hoá học cao). Người ta còn gọi các liên kết này là liên kết giàu năng lượng hay liên kết thế năng vận chuyển nhóm cao. Hàm lượng năng lượng cao của các liên kết này trình bày trong bảng 4.1.

Bảng 4.1. Giá trị AG⁰ khi thuỷ phân các liên kết cao năng.

Liên kết	AG0 (kJ/mol)	Liên kết	AG0 (kJ/mol)
Pyrophsphat	25,1	Acetylphosphat	36,4
Acetyl-Coenzym A	26,4	Creatinphosphat	41,0
Adenosindiphosphat	27,2	Phosphoenlpyrovat	51,9
Adenosintriphosphat	32,7	Aminoacyladenylat	54,4

 Những dẫn liệu này là kết quả thuỷ phân các liên kết cung cấp năng lượng tự do cao. Bảng 4.1. khái quát về các hợp chất tiêu biểu nhất, cũng như những thay đổi năng lượng tự do khi thuỷ phân các liên kết này trong các điều kiện tiêu chuẩn. Còn khi thuỷ phân các liên kết esterphosphat thông thường chỉ giải phóng 10-16 kJ/mol.

Từ bảng 4.1 cho thấy, các liên kết giàu năng lượng đều có chứa gốc phosphat. Các gốc phosphat này hoặc là gắn với axit phosphoric hay gắn với một gốc axit yếu khác theo kiểu liên kết anhydrid. Trong số các liên kết phosphat này thì adenosintriphosphat (ATP) là hợp chất quan trọng nhất. Từ đó, tế bào có thể sử dụng ATP để thực hiện các phản ứng tiêu hao năng lượng trong quá trình tồn tại, sinh trưởng và phát triển của chúng, trong đó gốc phosphat được chuyển đến các chất nhận thích hợp và sử dụng thế năng vận chuyển nhóm cao của ATP.

            4.2. Quá trình tổng hợp ATP

4.2.1. Sơ lược về sự tổng hợp ATP ở tế bào

Nồng độ ATP bên trong tế bào thường 10-10 mM. ATP có thể được sản xuất bởi các phản ứng khử bằng cách sử dụng các loại đường đơn giản và phức tạp (carbohydrates) hoặc lipid. Đối với ATP được tổng hợp từ các loại nhiên liệu phức tạp, trước tiên chúng được thủy phân thành các thành phần đơn giản. Carbohydrates được thuỷ phân thành đường đơn, như glucose và fructose. Chất béo (triglycerides) được chuyển hóa để cung cấp cho các axit béo và glycerol.

Quá trình oxy hóa glucose thành CO₂ và H₂O được gọi là hô hấp tế bào và có thể tạo ra từ 34-38 phân tử ATP từ một phân tử glucose. ATP được sản xuất bởi các quá trình riêng biệt của tế bào. Ba con đường chính được sử dụng để tạo ra năng lượng trong các sinh vật eukaryotic là glycolysis; chu trình acid citric, oxy hóa phosphoryl hóa và beta-oxy hóa. Phần lớn ATP trong các tế bào có nhân thật được tổng hợp  trong ty thể qua quá trình hố hấp hiếu khí.

 + Quá trình đường phân (Glycolysis)

 Trong glycolysis, glucose và glycerol được chuyển hóa thành pyruvate. Trong hầu hết các sinh vật, quá trình này xảy ra trong tế bào chất, nhưng trong một số động vật nguyên sinh như kinetoplastid được thực hiện trong một cơ quan chuyên biệt gọi là glycosome. Glycolysis tạo ra hai phân tử ATP thông qua quá trình phosphoryl hóa cơ chất và được xúc tác bởi hai enzymes: PGK và pyruvate kinase. Hai phân tử NADH cũng được tạo ra và chúng được oxy hóa qua các chuỗi vận chuyển điện tử và tạo ra ATP qua enzym ATP synthase. Các phân tử pyruvate tham gia vào chu trình Krebs.

+Chu trình acid citric và oxy hóa phosphoryl hóa

Trong ty thể, pyruvate bị ôxi hóa tạo thành acetyl CoA dưới sự xúc tác của enzym pyruvate dehydrogenase, sau đó bị ôxi hóa thành CO₂ và H₂O qua  chu trình acid citric (còn gọi là chu trình Krebs). Mỗi chu kỳ tạo ra hai phân tử của CO₂ , một phân tử ATP (GTP) thông qua quá trình phosphoryl hóa cơ chất; ba phân tử NADH và một phân tử các FADH₂ . NADH và FADH₂ tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử tạo ra ATP qua enzym ATP Synthase.   Mỗi phân tử NADH tổng hợp được từ 2-3 phân tử ATP và mỗi phân tử  FADH₂ tổng hợp khoảng 1,5 phân tử ATP.  Phần lớn ATP được tạo ra bởi quá trình này. Mặc dù chu trình acid citric không liên quan đến phân tử oxy, nó là một quá trình yếm khí. Tuy nhiên,  vì O₂ cần thiết cho việc tái tạo  FAD⁺ và NAD⁺ nên ảnh hưởng đến chu trình Krebs. Thiếu oxy sẽ làm cho chu trình acid citric sẽ ngừng lai vì thiếu NAD+ và FAD⁺.

NADH từ tế bào chất vào ty thể qua các con thoi malat-aspartate (hoặc con thoi glycerol-phosphate) bởi vì các màng ty thể là không thấm với NADH và NAD⁺. Thay vận chuyển NADH qua màng, một enzyme dehydrogenase malat oxaloacetate chuyển hóa thành malat, malat thấm vào nội chất ty thể. Dưới sự xúc tác của enzym malat dehydrogenase, malat được biến đổi ngược lại, tạo ra oxaloacetate và NADH. Sau đó oxaloacetate được vận chuyển trở lại qua màng đến tế bào chất.

Trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, việc chuyển giao các điện tử từ NADH và FADH₂ qua chuỗi vận chuyển điện tử đã tạo ra bơm proton từ nội chất ty thể đến không gian giữa hai lớp màng. Điều này tạo ra một động lực proton hay một gradient pH và một gradient điện thế giữa hai lớp màng ty thể. Dòng các proton sẽ vận chuyển từ không gian giữa hai lớp màng đến nội chất ty thể tạo ra động lực cho sự tổng hợp của ATP của enzym ATP synthase. Enzyme này chứa một tiểu đơn vị có thể quay trong quá trình tổng hợp ATP.

+ Beta hóa

Các axit béo được phân cắt để tạo thành acetyl-CoA bởi quá trình beta oxy hóa. Mỗi vòng của chu kỳ làm giảm độ dài của chuỗi acyl hai nguyên tử carbon và tạo một phân tử NADH và FADH₂, chúng cũng được sử dụng để tạo ra ATP bằng cách phosphoryl hóa oxy hóa. Bởi vì NADH và FADH₂ là các phân tử giàu năng lượng,  rất nhiều phân tử ATP có thể được tạo ra bởi quá trình oxy hóa-beta của một chuỗi acyl. Điều này giải thích tại sao chất béo cho nhiều năng lượng.

+ Sự hô hấp yếm khí

Hô hấp hoặc lên men kỵ khí là quá trình ôxi hóa không có O₂ như một nguồn tiếp nhận electron. Trong hầu hết các sinh vật nhân chuẩn, glucose được sử dụng như chất tạo năng lượng và tạo ra điện tử. Phương trình oxy hóa glucose thành acid lactic như sau:

C₆H₁₂O₆  à    2CH₃CH(OH)COOH + 2ATP

Ở sinh vật nhân sơ, các chất nhận điện tử có thể được sử dụng trong hô hấp kỵ khí. Chúng bao gồm nitrat, sulfat hoặc carbon dioxide. Các quá trình này dẫn đến các quá trình sinh thái quan trọng như nitrat hóa, giảm sulfate và acetogenesis.

+Sự bổ sung ATP bởi diphosphate kinaza nulceosit

ATP cũng có thể được tổng hợp bổ sung qua phản ứng xúc tác bởi các enzyme của kinase nucleoside diphosphate (NDKs), trong đó sử dụng Diphosphates nucleoside khác như là nguồn cung cấp phosphate giàu năng lượng cao để tạo ATP:

ADP + ADP à ATP + AMP

+ ATP sản xuất trong quá trình quang hợp.

Ở thực vật, ATP được tổng hợp trong màng thylakoid của lục lạp trong khi các phản ứng phụ thuộc vào ánh sáng của quang hợp trong quá trình gọi là photophosphorylation. Ở đây, năng lượng ánh sáng được sử dụng để bơm proton qua màng lục lạp. Điều này tạo ra một động lực proton và làm quay các tiểu phần của ATP synthase, như quá trình phosphoryl hóa oxy hóa.  Các phân tử ATP được sản xuất trong các lạp lục được tiêu thụ trong chu trình Calvin, tạo ra đường triose.

+ Sự tái tạo ATP.

Các phân tử ATP được tổng hợp từ  ADP qua các quá trình đã nói ở trên. Vì thế, ở bất kỳ thời điểm nào, trong tế bào tổng lượng ATP và ADP là tương đối ổn định. Hàng ngày, năng lượng các tế bào của con người sử dụng qua sự thủy phân khoảng 50-70 kg ATP. Như vậy, một người sẽ sử dụng hết khối lượng ATP tương đương khối lượng cơ thể trong một ngày. Điều này có nghĩa là mỗi phân tử ATP được tái chế 1000-1500 lần trong một ngày (100/0,1=1.000). ATP không thể được lưu trữ, do đó nó được sử dụng ngay sau khi tổng hợp ra.

4.2.2. Thuyết thẩm thấu hóa học

Thuyết hóa thẩm thấu dựa trên tính thấm proton H⁺ qua màng ty thể.  Quá trình vận chuyển e- trong chuỗi hô hấp tạo thành gradient proton ở màng trong ty thể. Chính sự hình thành gradient này đã làm cho các thành phần của chuỗi hô hấp “thay đổi trạng thái và chức năng đặc biệt”, không xếp theo trình tự. Kết quả của quá trình này là tạo nên một vùng vận chuyển proton ở màng trong ty thể. Hai proton của phân tử hydro đã tách ra từ NADH₂ được đi vào không gian giữa hai lớp màng nhờ bơm proton, các e- từ hệ thống oxy hóa được trung tâm Fe–S–Pr tiếp nhận và vận chuyển trở lại. Như vậy, sự xuất hiện gradient proton là động lực thúc đẩy tổng hợp ATP.

Thuyết hóa thẩm thấu dựa vào 3 quan điểm sau đây:

-Màng trong ty thể có tính bán thấm proton.

-Chuỗi hô hấp có tác dụng như một bơm proton.

-Tổng hợp ATP thực hiện bằng ATPsynthase hoạt động không đồng thời một hướng.

Màng trong ty thể có 2 bơm proton: một hình thành do gradient proton, còn bơm thứ hai là ATPsynthase có tác dụng tổng hợp ATP:     ATP  + Pi à ATP. Như vậy, bơm proton hoạt động nhờ hệ thống oxy hóa khử chuỗi hô hấp. Khi chuyển từ trạng thái kị khí sang trạng thái hiếu khí thì ty thể tạo ra dòng proton ty thể.

Luận điểm cơ bản của thuyết thẩm thấu hóa học là màng ty thể thuộc nhóm màng có khả năng biến đổi gradient nồng độ H⁺ thành năng lượng  sinh học là ATP. Tính chất đặc biệt này không chỉ riêng ở ty thể mà còn có ở màng lạp thể và màng vi khuẩn.  Màng ty thể có khả năng chuyển hóa năng lượng oxy hóa hydro thành năng lượng sinh học ATP. Đây là một nguyên tắc chuyển hóa năng lượng đặc biệt trong tự nhiên.  Năng lượng gradient proton có nguồn gốc sinh hóa học, không cần phải tạo thành ATP trung gian. Từ đó có thể suy luận rằng: vi khuẩn cũng có những quá trình vận chuyển nhất định và màng ngoài có khả năng tổng hợp ATP trực tiếp bằng gradient proton hay kết hợp với gradient điện thẩm hóa hoc.

Người ta đã tiến hành 2 thí nghiệm để chứng minh sự thẩm thấu hóa học kèm theo quá trình tổng hợp ATP.

Thí nghiệm 1 đã chứng minh giả thuyết tổng hợp ATP là kết quả của một gradient proton H⁺ ở màng trong ty thể. Trong thí nghiệm này, màng trong ty thể không cần nguồn vận chuyển điện tử để tổng hợp ATP khi các nhà nghiên cứu tạo ra sự chênh lệch nồng độ H⁺. Một mẫu của ty thể bị cô lập đã được tiếp xúc với một nồng độ H⁺ thấp đã đột ngột đưa vào môi trường với sự tập trung H⁺ với nồng độ cao. Màng ngoài ty thể không giống như màng trong, tự do thấm H⁺, do đó, H⁺ nhanh chóng khuếch tán vào trong không gian màng. Điều này tạo ra một gradient nhân tạo qua màng trong ty thể và quá trình tổng hợp ATP từ ADP và P_i được diễn ra. Điều này hỗ trợ giả thuyết và cung cấp bằng chứng mạnh mẽ cho cơ chế tổng hợp ATP.

Thí nghiệm 2 đã kiểm tra giả thuyết rằng enzyme ATP synthase kết hợp với gradien proton để tổng hợp ATP. Trong thí nghiệm này, bơm proton được cô lập từ một loại vi khuẩn được bổ sung vào các túi màng nhân tạo. Khi một nguồn năng lượng được cung cấp, H⁺ được bơm vào bên trong những cái túi, tạo ra gradient. Người ta đã gắn ATPsynthase được tách ra từ ty thể của động vật có vú vào màng nhân tạo này và quá trình tổng hợp ATP đã xảy ra. Kết quả này đã chứng minh enzyme ATP synthase trên màng đã xúc tác cho phản ứng tổng hợp ATP.

4.2.3.Cấu tạo và cơ chế hoạt động của enzym ATPsynthase

Enzim ATPsynthase gồm có hai miền: Miền Fo có  kênh proton và trục; miền F₁ có màu đỏ và màng màu xám.  Enzim tổng hợp ATP còn được gọi là complex V, là enzim cuối cùng trong con đường phosphoryl hóa oxy hóa . Enzim tổng hợp ATP được tìm thấy trong mọi hoạt động sống và hoạt động như nhau ở tế bào nhân sơ và tế bào nhân thực. Enzim này dùng năng lượng dự trữ từ sự chênh lệch proton (gradien proton) xuyên qua màng  để thúc đẩy sự tổng hợp ATP từ ADP và  phosphat vô cơ (Pi). Để tổng hợp 1 ATP cần 3-4 proton. Ở một số tế bào số lượng proton để tổng hợp 1 phân tử ATP có thể thay đổi:

ADP + Pi + 4H⁺ (cytosol) à  ATP + H2O + 4H⁺ (matrix) 

Phản ứng phosphoryl hóa là một hệ cân bằng động, có thể chuyển dịch bằng cách thay đổi lực đẩy proton. Khi có mặt lực đẩy proton thì phản ứng tổng hợp ATP diễn ra theo chiều từ phải sang trái (phản ứng nghịch), để phân giải ATP và bơm proton ra khỏi vùng cơ chất (matrix)  xuyên qua màng. Khi lực đẩy proton lớn thì  phản ứng diễn ra theo chiều ngược lại từ trái qua phải, làm cho gradien nồng độ proton hạ xuống và ADP chuyển thành ATP

Enzim tổng hợp ATP là một phức hợp lớn có cấu tạo dạng cây nấm. Ở động vật có vú phức hợp này chứa 16 tiểu phần nhỏ, có khối lượng khoảng 600kD. Phần nằm trong màng gọi là F_o: chứa một vòng các tiểu phần c và kênh proton, một cái cuống và đầu dưới hình cầu như quả banh gọi là F₁ và là vị trí mà ATP sẽ được tổng hợp. Ở phía cuối  đầu hình quả banh của F₁ có chứa 6 phân tử Protein với hai kiểu khác nhau ( 3 tiểu phần  alpha và 3 tiểu phần beta)

          Còn cái cuống là một protein chuỗi gamma, có đầu cuối kéo dài đâm sâu vào đầu hình quả banh và các tiểu phần  alpha và  beta. Cả hai tiểu phần alpha và  beta đều liên kết với các nucleotit, nhưng chỉ có tiểu phần beta xúc tác phản ứng tổng hợp ATP. Kéo dài theo phần F₁ quay ngược vào màng là một tiểu phần hình gậy cấm sâu vào các  tiểu phần  alpha và  beta  vào  đến chân đế của enzim.

Khi các proton xâm nhập vào, chúng qua màng xuyên qua kênh vào đế của  enzim tổng hợp ATP thì động cơ điều khiển proton Fo quay tròn. Sự xoay này có thể được gây ra bởi sự thay đổi trong quá trình ion hóa các axit amin trong tiểu phần c , gây ra sự tương tác tĩnh điện thúc đẩy vòng c chạy xuyên qua kênh proton. Vòng xoay này đến lượt sẽ điều khiển  sự xoay tròn của trục trung tâm (là tiểu phần gamma) ở giữa  hai tiểu phần alpha và  beta. Hai tiểu phần alpha và  beta sẽ bị ngăn sự xoay quay chúng bằng tay đòn ngang hoạt động như một stator của máy phát điện. Sự chuyển động của đầu mút  của tiểu phần gamma trong quả cầu alpha và  beta cung cấp năng lượng cho hoạt động bên trong tiểu phần beta trãi qua một chu kỳ chuyển động sẽ giải phóng ATP.

Cấu trúc các thành phần của  Enzim tổng hợp ATP : ATP có màu đỏ, ADP và Pi có màu hồng, còn tiểu phần xoay tròn gamma có màu đen.

Phản ứng tổng hợp ATP là cơ chế chuyển đổi liên kết liên quan đến vai trò tích cực của tiểu phần beta, xoay tròn giữa 3 trạng thái:

- Trạng thái mở: ADP và Pi xâm nhập vào trung tâm hoật động của enzim (vị trí tích cực). Protein tiến gần đến phân tử và liên kết lỏng lẽo với chúng.

- Trạng thái rời rạc:  enzim  thay đổi hình dạng và liên kết các phân tử này với nhau trong trung tâm hoạt động dẫn đến trạng thái chặt.

-Trạng thái chặt : liên kết những phân tử ATP mới hình thành với ái lực cao, cuối cùng trung tâm hoạt động tích cực này quay lại trạng thái mở giải phóng ATP và kết  hợp thêm ADP với Pi , sẳn sàng cho chu kỳ tiếp theo.

2.2.4.Các chất ức chế quá trình tổng hợp ATP

Có vài loại thuốc và độc tố có khả năng ức chế quá trình phosphoryl hóa oxy hóa. Bất kỳ một chất nào trong số các độc tố cũng có khả năng ức chế chỉ một enzim trong dây chuyền vận chuyển điện tử, và ức chế bất kỳ bước nào trong quá trình này cũng làm chặn đứng phần còn lại của tiến trình.

Ví dụ  oligomycin ức chế  Enzim tổng hợp ATP, proton không thể đi ngược vào trong ty thể, kết quả là bơm proton không thể hoạt động khi gradien trở nên quá lớn cho chúng vượt qua. NADH không còn bị oxy hóa nữa và chu trình acide citrite ngừng hoạt động bởi vì nồng độ NAD⁺  tụt xuống dưới mức mà các enzim có thể hoạt động.

Các hợp chất	Cách dùng	Hiệu lực trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa
Cyanide Cacbonmonoxide	Thuốc độc	Ức chế dây chuyền vận chuyển điện tử,bằng cách liên kết mạnh oxy vào trung tâm Fe-Cu trong cytocrom oxidase, ngăn chặn sự khử oxy
Oligomycin	Kháng sinh	Ức chế  Enzim tổng hợp ATP bằng cách ngăn chặn dòng proton đi qua tiểu phần Fo
CCCP 2,4- Dinitrophenol	Thuốc độc	Ion hóa nhằm bẻ gãy gradien proton bằng cách vận chuyển các proton đi qua màng .Bơm các proton ion  hóa  không  kết cặp trong  tổng hợp ATP bởi vì nó mang proton qua màng trong ty thể
Rotenone	Trừ côn trùng gây hại	Ngăn chặn dây chuyền vận chuyển điện tử từ phức hệ I tới ubiquinone bằng cách chặn các vị trí liên kết ubiquinone
Malonate và oxaloacetate		Cạnh tranh với các chất ức chế của  succinate dehydrogenase  ( phức hệ II)

Trong tế bào không chỉ có các  chất ức chế  là các độc tố  ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa oxy hóa  mà còn có các chất có trong mô mỡ màu nâu, là các protein điều tiết kênh proton, chúng là các protein không cặp đôi có thể không kết cặp với chuỗi hô hấp để tổng hơp ATP. Quá trình này nhanh chóng tạo nhiệt, và là con đường đặc biệt quan trọng  nhằm bảo đảm thân nhiệt cho động vật khi ngủ đông. Mặc khác các protein này còn có chức năng quan trọng trong việc ngăn chặn trình trạng stress cho tế bào.